原則葉綠素廣泛存在于水果、蔬菜等綠色植物組織中，在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合形成葉綠體。植物細(xì)胞死亡時(shí)，葉綠素是游離的，游離的葉綠素很不穩(wěn)定，對(duì)光熱敏感；在酸性條件下，葉綠素產(chǎn)生綠褐色的脫鎂葉綠素，脫鎂葉綠素在稀酸堿液中水解成亮綠色的葉綠素以及葉綠醇和甲醇。高等植物中的葉綠素有兩種：葉綠素a和b，均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
葉綠素含量的測(cè)定方法很多，主要有：
1、原子吸收光譜法：通過(guò)測(cè)定鎂的含量，進(jìn)而間接計(jì)算出葉綠素的含量。
2、分光光度法：用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取物在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度值，利用朗伯-比爾定律計(jì)算提取物中各色素的含量。
葉綠素a和葉綠素b在645nm和663nm處有最大吸收，兩條吸收曲線在652nm處相交。因此，測(cè)定提取物在645nm、663nm、652nm波長(zhǎng)處的吸光度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量。
材料和儀器
植物材料96%乙醇丙酮石英砂碳酸鈣粉分光光度計(jì)電子頂載天平砂漿棕色容量瓶定量濾紙吸水紙擦拭紙滴管漏斗
步驟
1、取新鮮植物葉子（或其他綠色組織）或干燥材料，擦去組織表面的污垢，去除中脈，切塊。稱(chēng)取剛切碎的樣品2g，放入研缽中，加入少量石英砂、碳酸鈣粉和3mL95%乙醇，研磨成均質(zhì)漿液，加入10mL乙醇，繼續(xù)研磨直到組織變白。靜置 3-5 分鐘。
2、取一張濾紙置于漏斗中，用乙醇潤(rùn)濕，將提取物沿玻璃棒倒入漏斗中，濾液流入100mL棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽和研杵及殘?jiān)鼣?shù)次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?br/>3、用滴管吸乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直到濾紙上沒(méi)有綠色和殘留物為止。最后，用乙醇稀釋至100mL，搖勻。
4、取葉綠體色素提取物分別在665nm、645nm和652nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以95%乙醇為空白對(duì)照。
防范措施
1、光照對(duì)葉綠素有破壞作用。實(shí)驗(yàn)應(yīng)在弱光下進(jìn)行，研磨時(shí)間盡量短。
2、如果色素提取液中混有其他物質(zhì)引起混濁，會(huì)影響吸光度的測(cè)定，應(yīng)重新過(guò)濾或離心。
3、測(cè)量色素的吸光度前，應(yīng)根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)和標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a、b校準(zhǔn)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)，否則會(huì)影響葉綠素含量的測(cè)量精度。
常見(jiàn)問(wèn)題
1、無(wú)水乙醇提取時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)某些物質(zhì)尤其是木本植物的葉綠素提取不夠完全。無(wú)水丙酮萃取會(huì)出現(xiàn)渾濁，影響比色測(cè)定。因此，提取葉綠素最好選擇丙酮和無(wú)水乙醇，比例為2：1效果更佳。
2、傳統(tǒng)的80%丙酮法由于含水量高，提取速度慢，測(cè)定值低，葉綠素穩(wěn)定性差，應(yīng)慎用。原則葉綠素廣泛存在于水果、蔬菜等綠色植物組織中，在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合形成葉綠體。植物細(xì)胞死亡時(shí)，葉綠素是游離的，游離的葉綠素很不穩(wěn)定，對(duì)光熱敏感；在酸性條件下，葉綠素產(chǎn)生綠褐色的脫鎂葉綠素，脫鎂葉綠素在稀酸堿液中水解成亮綠色的葉綠素以及葉綠醇和甲醇。高等植物中的葉綠素有兩種：葉綠素a和b，均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。